تربية الذباب والأسهم

تم تربية الذباب على وسط دقيق الذرة القياسي عند 25 درجة مئوية في إطار دورة مظلمة للضوء مدتها 12 ساعة – 12 ساعة. لتعزيز مستويات التعبير عن الجينات المحورة، تم تحويل الذباب من جميع تجارب الاضطراب الوراثي، بما في ذلك مجموعات المراقبة، إلى 29 درجة مئوية قبل وقت قصير من تكوين البوباريوم. يتم سرد الأنماط الجينية التفصيلية لكل تجربة في الجدول التكميلي 1.

الاستنساخ الجزيئي وتوليد الذباب المعدل وراثيا

لإنشاء خطوط QF2، استخدمنا ناقلات pENTR/D-TOPO مع العديد من عمليات الإدراج المُحسّنة (هدايا من مختبر G. Rubin) كمتجهات دخول لاستنساخ البوابة في ناقل pBPQF2Uw باستخدام مزيج LR Clonase II Enzyme (Invitrogen، 11791020). تم تصنيع pBPQF2Uw باستخدام المزيج الرئيسي لتجميع DNA NEBuilder HiFi (New England Biolabs) لاستبدال GAL4 على ناقل pBPGAL4.2Uw-2 (Addgene، 26227) مع QF2 من pBPGUw-HACK-QF2 (Addgene، 80276). تم التحقق من تسلسل التركيبات الناتجة وإدراجها في مواقع الهبوط JK22C بواسطة Bestgene. تم تصنيع pGP-5XQUAS-IVS-Syn21-jGCaMP8m-p10 باستخدام المزيج الرئيسي لتجميع DNA NEBuilder HiFi (New England Biolabs) لاستبدال 20XUAS على ناقل pGP-20XUAS-IVS-Syn21-jGCaMP8m-p10 (Addgene، 162387) مع 5XQUAS من pQUAST (Addgene، 24349). تم حقن البلازميدات في الأجنة في BestGene. ومن غير المرجح أن تؤدي العلامات الجينية التي تحمل هذه المحركات إلى تعطيل النمو الطبيعي؛ أظهرت دراسة سابقة أن برامج التشغيل ذات كفاءة الترجمة المحسنة يمكن أن تزيد من تعبير GFP بمقدار 20 ضعفًا دون أي تأثير واضح على التشكل العصبي³⁷.

المناعية

وقد تم وصف الإجراءات المستخدمة لتشريح الذبابة، وتثبيت الدماغ، وتلطيخ المناعة سابقًا¹⁰. بالنسبة للأجسام المضادة الأولية، استخدمنا الفئران المضادة DNcad (1:30، DSHB، RRID AB_528121)، الدجاج المضاد GFP (1: 1000، Aves Labs، RRID AB_10000240)، الأرنب المضاد DsRed (1: 500، Takara Bio، RRID AB_10013483) والماوس المضاد للفئران CD2 (1: 200، بيو راد، OX-34).

التصوير متحد البؤر

تم تصوير العقول المناعية باستخدام مجهر متحد البؤر المسح بالليزر (Zeiss LSM 780). تم التقاط صور للفصوص قرون الاستشعار كمداخن متحد البؤر بمقاطع يبلغ سمكها 1 مم. تم عرض المقاطع الفردية التمثيلية لتوضيح ميزات التشجير لمحاور ORN والتشعبات PN، مع تعديل السطوع وتعديل التباين واقتصاص الصورة في ImageJ.

حساب النسبة المئوية لمحاور ORN المطابقة مع التشعبات PN

تم تعريف وحدات البكسل التغصنية PN وبكسلات ORN المحورية عن طريق تنعيم الصورة أولاً باستخدام “التمويه الغوسي” (نصف القطر = 2 بكسل) ثم تحديد عتبة الصورة بناءً على خوارزمية “Otsu” في فيجي. لقد وجدنا أن هذه الخوارزمية يمكنها فصل الخلايا العصبية محل الاهتمام بكفاءة عن الخلفية. تم إخفاء الإشارات غير ذات الصلة (مثل محاور PN أو أجسام الخلايا أو التألق الذاتي) التي لا تزال قائمة بعد هذه العمليات يدويًا في التحليل. تم اعتبار جزء من محاور ORN متطابقًا مع التشعبات PN إذا كانت تحتوي على وحدات بكسل متداخلة على نقطة واحدة ض-الطائرة في الصورة. لاحظ أن تعريف الكبيبة يصبح غامضًا حيث أن محاور ORN والتشعبات PN تعصب أكثر فأكثر خارج الكبيبة الأصلية.

التداخل المحسوب بين محاور ORN والتشعبات PN دائمًا أقل من 100%. وذلك لأن محاور ORN أو التشعبات PN لا تشغل الكبيبة بأكملها، لسبب تقني ولسبب بيولوجي. من الناحية الفنية، إذا فحص المرء المحاور والتشعبات بدقة فائقة، فلا ينبغي لها أن تتداخل على الإطلاق، لأن كل مساحة مادية يجب أن يشغلها كيان واحد فقط إذا كانت الدقة عالية بما فيه الكفاية. في تقديراتنا الكمية، استخدمنا “التمويه الغاوسي” لتلخيص أفضل للمناطق المجاورة لمحور عصبي واحد أو التشعبات التي ينبغي اعتبارها “تداخل”. هذه معلمة تجريبية ولن تحقق تداخلًا بنسبة 100%. من الناحية البيولوجية، بالإضافة إلى نقاط الاشتباك العصبي ORN-PN، تشكل كل من ORNs وPNs أيضًا نقاط اشتباك عصبي متبادلة مع LNs ذات الفص الهوائي. المناطق التي تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي ORN-LN تفتقر إلى التشعبات PN؛ المناطق التي تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي PN-LN تفتقر إلى محاور ORN. وبالتالي، لا تتداخل محاور ORN والتشعبات PN في هذه المناطق.

في تحليلاتنا، نستخدم نفس المعلمات لتحديد جميع الحالات الوراثية. وبالتالي، فإن استنتاجاتنا حول تغيير ORN-PN تتداخل في ظل ظروف وراثية مختلفة لا ينبغي أن تتأثر بهذه العوامل.

كاليفورنيا²⁺ التصوير وتحليل البيانات

تسليم المحفزات الرائحة

تم تطبيق عشرة ميكروليترات من PA (Thermo Fisher Scientific، 376910010) أو عشرة ميكروليترات من cVA (Cayman Chemical، 10010101) على ورق الترشيح (Amazon، B07M6QJ2JX) الذي تم إدخاله داخل طرف ماصة سعة 1 مل. يُترك طرف الماصة جانبًا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضعه على بعد حوالي 5 مم من هوائي الطيران. يعد تحديد المواقع القريبة من PA وcVA ضروريًا لأن كلا الروائح عبارة عن جزيئات فرمون كبيرة ذات تقلبات منخفضة نسبيًا. كما تم استخدام هذه الطريقة في دراسات أخرى¹². تم تخزين الروائح الأخرى، مثل MP (Thermo Fisher Scientific، L05509.36)، MM (Thermo Fisher Scientific، 165015000) وfarnesol (Thermo Fisher Scientific، 119121000)، في قنينة زجاجية صغيرة وتم تسليمها إلى هوائي الذبابة من خلال الأنابيب، مع تخفيف بنسبة 10٪ في الزيوت المعدنية الثقيلة في يوم التجارب. تم توجيه تيار مستمر من الهواء المفلتر بالفحم (1 لتر في الدقيقة) نحو الذبابة، والتحول إلى الهواء المحتوي على الرائحة لمدة ثانية واحدة كمحفز للرائحة قبل العودة إلى تيار الهواء. كان نبض الهواء المفلتر بالفحم بمثابة عنصر تحكم سلبي. تم تشذير الروائح، بما في ذلك نبض التحكم، بفواصل زمنية لا تقل عن 15 ثانية. تم تسليم كل رائحة مرتين إلى ثلاث مرات لكل تسجيل، مع تعديل تسلسل التسليم داخل كل دورة. كما هو موضح سابقا³⁸، قمنا بلصق الذباب على مرحلة مخصصة. كما اتبعت بروتوكولات التشريح والتصوير دراسة سابقة³⁸.

الحصول على البيانات ومواءمتها

استخدمنا مجهر ثنائي الفوتون مع هدف متحرك (Ultima IV، Bruker). تم ضبط الليزر ثنائي الفوتون (Chameleon Ultra II Ti: Sapphire، Coherent) على 925 نانومتر في جميع تجارب التصوير. استخدمنا هدف ×16 / 0.8 NA (نيكون) لجميع تجارب التصوير. كانت شدة الليزر في العينة 15-30 ميجاوات. يقوم ثنائي اللون بطول 575 نانومتر بتقسيم ضوء الانبعاث. تم استخدام مرشح تمرير النطاق 490-560 نانومتر (Chroma) للقناة الخضراء وتم استخدام مرشح تمرير النطاق 590-650 نانومتر (Chroma) للقناة الحمراء. سجلنا جميع بيانات التصوير باستخدام واحد ض-المستوى، بمعدل 9-13 هرتز. لقد قمنا بتزويد الدماغ بمحلول ملحي خارج الخلية يتكون من 103 ملي كلوريد الصوديوم، 3 ملي كلوريد كلوريد، 5 ملي مولار. ن-تريس (هيدروكسي ميثيل) حمض ميثيل -2 أمينو إيثان سلفونيك (TES)، 10 ملي مولار تريهالوز، 10 ملي مولار جلوكوز، 2 ملي مولار سكروز، 26 ملي مولار NaHCO₃، 1 ملم ناه₂ص₄، 1.5 ملي مولار CaCl₂ و 4 ملي MgCl₂. تمت ترقيم جميع البيانات بواسطة محول الأرقام Digidata 1550b (الأجهزة الجزيئية) بسرعة 10 كيلو هرتز، باستثناء الصور ثنائية الفوتون، التي تم الحصول عليها باستخدام PrairieView (Bruker) بترددات متفاوتة وحفظها كملفات TIFF لتحليلها لاحقًا. استخدمنا مشغلات الإطار المرتبطة بإطارات التصوير الخاصة بنا (من Prairie View)، المسجلة على Digidata 1550b، لمحاذاة تسليم الرائحة بعناية مع Ca²⁺ قياسات التصوير.

تسجيل الصور

تم تصحيح مجموعات الصور باستخدام تصحيح الحركة غير الصلبة (NoRMCorre³⁹) ثم يتم التحقق من صحتها يدويًا للتحقق من وجود آثار متحركة.

تحديد المناطق ذات الاهتمام

لتحليل كاليفورنيا²⁺ بيانات التصوير، قمنا بتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROIs) في فيجي وبيثون لإشارات GCaMP من التشعبات PN في نصف الكرة الأرضية، أو كلا نصفي الكرة الأرضية عندما كانت الإشارات الجذعية PN متاحة. لقد تعاملنا مع التشعبات PN بأكملها من نصف الكرة الأرضية كعائد استثمار واحد.

حساب شدة مضان

استخدمنا عائد الاستثمار، المحدد أعلاه، كوحدة لحساب شدة الفلورسنت (انظر أعلاه). لكل عائد استثمار، قمنا بحساب متوسط ​​قيمة البكسل في كل نقطة زمنية ثم استخدمنا الطريقة ∆ف/ف₀ لحساب أين ف₀ هو متوسط ​​أقل 5% من قيم الفلورسنت الخام في عائد استثمار معين مع مرور الوقت و∆ف يكون ف– ف₀.

فحص الخطوبة

تم جمع الذباب بعد وقت قصير من حدوث الكسوف. تم إيواء الذباب الذكور بشكل فردي، في حين تم إيواء الذباب الإناث (كانتون-S) في مجموعات من حوالي عشرة. جميع الإناث المستخدمة كأهداف للتودد كانت عذارى تتراوح أعمارهن بين ثلاثة إلى خمسة أيام. جميع الذكور الذين تم اختبارهم في التجارب لم يتزاوجوا. كان عمر الذكور من أربعة إلى سبعة أيام في الشكل 1. 4 والبيانات الموسعة الشكل. 8أ-د ويومين في البيانات الموسعة الشكل 1. 8ه-ط لخفض خط الخطوبة عند الذكور. جميع الذباب الذكور كانوا كذلك ث⁺، أوث^– لكنهم كانوا يحملون أكثر من ثلاث علامات بيضاء صغيرة من الجينات المحورة التي يمتلكونها. في فحوصات المغازلة الفردية، تم إدخال ذكرين (أو ذكر وأنثى) إلى غرفة مغازلة مخصصة يبلغ قطرها 2 سم. في اختبار سلسلة المغازلة، تم إدخال خمسة ذكور DA1-ORN → VA1v-PN إلى غرفة مغازلة مخصصة يبلغ قطرها 5 سم. تم إجراء تجارب المغازلة تحت ضوء أبيض منخفض لتقليل نشاط المغازلة الأساسي، لأن الرؤية معروفة جيدًا بالتأثير على قوة مغازلة الذبابة. قبل وضعها في غرفة المغازلة، تم تجميع الذباب لفترة وجيزة في أنبوب وتخديره على الجليد لمدة تقل عن 10 ثوان. بمجرد وضعها في الغرفة، كان معظم الذباب قادرًا على التحرك على الفور ولكنه لم يطير بعيدًا. تم تسجيل سلوك الطيران لأكثر من 25 دقيقة باستخدام كاميرا فيديو بمعدل 13 إطارًا في الثانية، وتم قياس أول 25 دقيقة. في اختبار المغازلة بين الذكور والذكور، كان عمر الذكر المسيطر والذكر المعاد توصيله متطابقين مع العمر، وتم وضع علامة على أحدهما بعلامة طلاء زيتي (Sharpie) على الصدر قبل يوم واحد على الأقل من التجربة. تم تناوب الطلاء بين الذكور المتحكمين والمعاد توصيلهم بالأسلاك. تم استخدام مصابيح LED (660 نانومتر) لتنشيط DA1-ORNs التي تعبر عن csChrimson.

الإحصائيات والاستنساخ

للحصول على الصور التمثيلية من الشكل. 1 ب، ج وأشكال البيانات الموسعة. 1أ،ب, 2ج-و, 6 ج، د و 10أ،بوتم فحص خمس عينات على الأقل وكانت لها نتائج مماثلة.

تصميم دراسة الطيران

لم يتم استخدام أي اختبارات إحصائية لتحديد حجم العينة. استخدمنا أحجام العينات (حوالي 6-20 ذبابة لكل حالة) والتي ثبت أن لديها قوة إحصائية كافية في تجارب مماثلة في الماضي. لم نستبعد الذباب أو البيانات من أي تحليل، إلا إذا ظهرت العقول الملطخة بالتصوير غير مناسبة (على سبيل المثال، مكسورة) في وقت التصوير. تم إجراء جميع التجارب التي تمت مناقشتها في الورقة على ذبابات متعددة، مع تحديد حجم العينة. بالنسبة لمعظم التجارب ثنائية الفوتون والتجارب السلوكية، تم جمع البيانات عبر عدة أيام مع نتائج متسقة. بالنسبة إلى تلطيخ المناعة، تم جمع البيانات عبر عدة أيام وأظهرت جميع العقول المصورة نفس النمط النوعي من التلطيخ. لا يتم تخصيص الكائنات الحية للمجموعات الضابطة والتجريبية من قبل المجرب في هذا العمل؛ بل إن الأنماط الجينية للذباب تحدد مجموعتهم. وبالتالي، فإن التوزيع العشوائي للأفراد في مجموعات العلاج ليست ذات صلة. لم يكن الباحثون أعمى عن النمط الجيني للطيران. وتمت جميع عمليات جمع البيانات وتحليلها حسابيا. خلال هذه العملية، تم تحليل البيانات من مجموعات المراقبة والمجموعات التجريبية بالتساوي باستخدام نفس البروتوكولات الراسخة، مما يقلل من تأثير المحقق.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاحة في ملخص تقارير محفظة الطبيعة مرتبطة بهذه المقالة.